十大功勞屬植物究竟立了哪十大功勞?
十大功勞屬(Mahonia)植物在我國約有50種,分布于南方各地。該屬植物主要以根、莖入藥,稱“刺黃連、刺黃柏、功勞木”等;有的地區(qū)以葉入藥,稱“功勞葉”〔1,2〕。有的用作提取“黃連素”、異漢防己甲素(isotetrandrine)的原料。已從該屬植物中發(fā)現(xiàn)20多種芐基異喹啉類生物堿,其中雙芐基異喹啉類的尖刺堿(oxyacanthine,Ⅰ)、小檗胺(berbamine,Ⅱ)、異漢防己甲素(Ⅴ)和原小檗堿類的小檗堿(berberine,Ⅶ)、藥根堿(jatrorrhizine,Ⅳ)、巴馬亭(palmatine,Ⅵ)、非洲防己胺(columbamine,Ⅲ)等成分分布廣泛,含量較高?,F(xiàn)代藥理實驗和臨床應(yīng)用結(jié)果表明,這些成分具有抗菌、消炎、抗病毒、降血壓、降血脂、抗心率失常、抗血小板聚集、抗衰老、鎮(zhèn)痛等生理活性〔3~11〕。
對十大功勞屬植物中生物堿成分測定的文獻報道較少。有文獻報道用薄層掃描法測定大葉刺黃柏中的Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ〔12〕;用薄層光密度法測定4種十大功勞屬植物莖中的Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、木蘭花堿(magnoflorine)〔13〕;用高效液相色譜法測定十大功勞葉中的Ⅶ〔14〕。作者在用變波長高效液相色譜法測定了小檗屬(Berberis)植物根中的生物堿的基礎(chǔ)上〔15〕,為了開發(fā)利用十大功勞屬植物資源,建立了高效液相色譜法測定十大功勞屬植物中的Ⅰ~Ⅶ的方法。這7種成分可用203 nm固定波長1次檢測,也可用203~346nm變波長2次檢測。但后者既使7種待測成分在各自的最大吸收波長處檢測,又避免了吸收波長不同的相鄰色譜峰的干擾,提高了分析的靈敏度和準確度。本文用變波長高效液相色譜法對我國產(chǎn)的十大功勞屬3種植物的根、根皮、根木、莖皮、莖木和10種不同產(chǎn)地的植物根中的Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ進行了定量分析,Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ因?qū)φ掌妨可?,只做了定性分析?br>
1 儀器與試藥
Waters高效液相色譜儀(510型泵,490E檢測器,U6K進樣器,Baseline 810色譜工作站)。
對照品:鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬亭、鹽酸藥根堿購于中國藥品生物制品檢定所;非洲防己胺由中國藥品生物制品檢定所涂國士研究員贈送;小檗胺購于中國科學(xué)院林業(yè)土壤研究所,經(jīng)重結(jié)晶純化;尖刺堿、異漢防己甲素由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所提供(所用對照品經(jīng)硅膠薄層層析、2種溶劑系統(tǒng)展開為單點;高效液相色譜法測定,主成分的峰高、峰面積均在97%以上)。植物標本由中國科學(xué)院植物研究所應(yīng)俊生研究員鑒定。乙腈為色譜純,甲醇和磷酸二氫鉀為分析純,去離子水。
2 實驗方法及結(jié)果
2.1 色譜條件〔15〕
色譜柱:μ-Bondapak phenyl(10μm,3.9mm×300mm,美國Waters公司);流動相:0.02mol.L-1磷酸二氫鉀-乙腈(7∶3);柱溫:室溫;流速:1.0mL.min-1;靈敏度:0.08AUFS;檢測波長:固定波長用203nm,變波長0.0~10.0min用203nm,10.0min以后用346 nm。7種生物堿對照品的色譜圖見圖1。
圖1 7種生物堿對照品的色譜圖(203 nm檢測)
Ⅰ.尖刺堿 Ⅱ.小檗胺 Ⅲ.非洲防己胺Ⅳ.藥根堿
?、?異漢防己甲素 Ⅵ.巴馬亭 Ⅶ.小檗堿
2.2 回歸方程及線性范圍
按文獻〔15〕,以進樣量(μg)為橫坐標(X),峰面積(microvolt-sec)為縱坐標(Y),求得回歸方程見表1。
2.3 樣品溶液的制備
精密稱取干燥樣品粉末0.1g于50mL磨口三角瓶中,加甲醇20mL,稱重,浸泡12h,超聲提取60min,稱重,補足損失的甲醇,搖勻,密閉,靜置;取5.0mL上清液于離心管中,密閉,離心(10000r.min-1,10min);取上清液(2.0mL)作為樣品溶液。
表1 4種生物堿定量分析的回歸方程和線性范圍
成分
回歸方程
r
線性范圍/μg
?、?br> Y=9.017X×104+4.318×105
0.9993(n=7)
0.019~0.296
Ⅳ
Y=4.239X×104-8.228×104
0.9999(n=9)
0.019~0.996
?、?br> Y=4.191X×104+1.446×105
0.9998(n=9)
0.020~1.008
Ⅶ
Y=4.209X×104+1.278×105
0.9998(n=9)
0.020~1.010
2.4 精密度試驗〔15〕
精密吸取一樣品溶液10μL進樣,重復(fù)測定10次。求得樣品中各成分濃度(μg.mL-1)的RSD(%):小檗胺 0.28,藥根堿 0.84,巴馬亭 0.75,小檗堿 1.21。
2.5 加樣回收率試驗
分別精密稱取狹葉十大功勞莖的干燥粉末0.05g5份于50mL磨口三角瓶中,按文獻〔15〕操作,每份重復(fù)測定3次;計算Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ的回收率,分別為97.2%~102.1%、98.9%~100.3%、97.2%~100.1%、99.4%~100.1%,RSD分別為2.0%、0.62%、1.3%、0.30%。
2.6 樣品分析〔15〕
精密吸取樣品溶液10μL進樣,用203~346nm變波長檢測,對Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ進行了定量分析,對Ⅰ、Ⅲ定性分析。再精密吸取10μL進樣,用203nm固定波長檢測,得到各樣品的特征圖譜,并定性分析成分Ⅴ。對十大功勞屬3種植物的根、根皮、根木、莖皮、莖木和10種不同產(chǎn)地的植物根中的7種生物堿的分析結(jié)果見表2、3。
3 討論
3.1 本文建立的方法能在同一個色譜條件下25min
表2 3種十大功勞屬(Mahonia)植物不同部位7種生物堿分析結(jié)果(%,n=2)
植物名稱
部位
Ⅰ
?、?br> Ⅲ
?、?br> Ⅴ
?、?br> ?、?br>
甘平十大功勞 Mahonia eurybracteata Fedde subsp.ganpinensis(H.Leveill)T.S.Ying et Boufford
(四川省中藥學(xué)校)
根
-
±
+
0.68
+
0.05
0.78
根皮
+
0.01
-
1.66
+
0.14
3.76
根木
+
±
+
0.69
+
0.06
0.84
莖皮
-
±
-
0.34
+
0.05
0.47
莖木
+
±
-
0.53
+
0.08
0.21
狹葉十大功勞 M.fortunei(Lindl.)Fedde
(重慶南川藥物種植所)
根
+
0.34
+
1.17
+
0.06
1.27
根皮
+
0.98
+
3.02
+
0.20
3.54
根木
+
0.18
+
0.54
+
±
0.70
莖皮
+
0.29
+
1.47
+
0.19
0.41
莖木
+
0.28
+
0.98
+
0.05
1.36
長苞十大功勞 M.longibracteata Takeda
(四川峨邊)
根
+
±
+
0.40
+
0.62
1.73
根皮
+
±
+
1.10
+
1.30
6.94
根木
-
±
+
0.33
+
0.80
0.98
莖皮
-
±
+
0.74
-
0.60
1.24
莖木
-
-
+
0.21
-
0.28
0.45
+:檢出該成分 -:未檢出該成分 ±:含量<0.01%
表3 10種十大功勞屬(Mahonia)植物根中7種生物堿分析結(jié)果(%,n=2)
植物名稱
產(chǎn)地
Ⅰ
?、?br> ?、?br> ?、?br> ?、?br> ?、?br> ?、?br>
闊葉十大功勞 Mahonia bealei(Fort.)Carr.
四川峨邊
+
±
+
0.44
+
0.78
1.44
重慶奉節(jié)
+
0.02
+
0.50
+
0.64
2.07
鼠刺十大功勞 M.bodinieri Gagnep.
重慶金佛山
+
0.10
+
0.81
+
0.09
0.77
重慶藥物種植所
+
0.08
+
0.79
+
0.06
1.11
重慶中藥研究院
+
±
+
0.41
+
0.05
0.78
湖南新化*
+
±
+
0.16
+
0.53
1.44
川鄂十大功勞M.eurybracteata Fedde subsp.eurybracteata
四川峨眉山
-
±
+
0.45
+
0.14
1.10
四川峨邊
-
±
+
0.82
+
0.12
1.22
重慶縉云山
+
±
+
0.35
+
0.02
0.73
甘平十大功勞 M.eurybracteata Fedde subsp.ganpinensis(H.Leveill)T.S.Ying et Boufford
重慶南川
+
0.01
+
1.01
+
0.04
1.58
四川省中藥學(xué)校
-
±
+
0.68
+
0.05
0.78
狹葉十大功勞 M.fortunei(Lindl.)Fedde
重慶藥物種植所
+
0.34
+
1.17
+
0.06
1.27
四川峨眉山
+
±
+
0.82
+
0.06
1.42
湖南新化*
+
0.19
+
0.88
+
0.07
0.59
細梗十大功勞 M.gracilipes(Oliv.)Fedde
四川峨眉山
-
±
+
0.67
+
0.15
0.99
長苞十大功勞M.longibracteata Takeda
四川峨邊
+
±
+
0.40
+
0.62
1.73
巖紫黃 M.nitens Schneid.
四川峨眉山
-
0.02
+
1.05
+
0.17
0.55
多齒十大功勞 M.polyodota Fedde
四川峨眉山
-
0.02
+
0.67
+
0.10
0.52
重慶金佛山
-
0.01
+
0.22
+
0.13
0.30
M.sp.(未定種名)
重慶金佛山
-
0.01
+
0.28
+
1.38
1.30
+:檢出該成分 -:未檢出該成分 ±:含量<0.01% *:測定部位是莖
內(nèi)測定十大功勞屬植物不同部位以及不同產(chǎn)地植物中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ 3種雙芐基異喹啉類和Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ 4種原小檗堿類生物堿。方法的重現(xiàn)性好、精密度高、適用范圍廣。
3.2 十大功勞屬與小檗屬植物親緣關(guān)系相近,化學(xué)成分相似。研究結(jié)果表明:能用相同或相近的HPLC色譜條件測定這兩屬植物中相同的生物堿成分。
3.3 在所測定的10種植物中,Ⅲ的峰很低,參照Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ的分子結(jié)構(gòu)和峰面積,推測Ⅲ的含量低于0.01%。Ⅰ和Ⅱ除狹葉十大功勞外,在其余植物中的峰較弱,含量較低;Ⅴ的峰在大多數(shù)植物中很強,含量高(本實驗中因?qū)φ掌妨可?,未定?。
3.4 這7種成分在該屬植物不同部位中的分布、含量有一定差別,其差異程度隨植物種類不同而異。含量基本上以根皮中最高,莖皮中次之,然后是根木部、莖木部。以往多以莖入藥〔1〕,但從分析結(jié)果看,其根也是不可忽視的資源。
作者單位:呂光華 華西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 成都610044
王立為 陳立民 肖培根 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所北京100094
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